季节性流感病毒目前仍是导致人类死亡的一大因素，除了造成肺损伤外，还可能导致或加剧心脏功能障碍。有大量证据表明心脏功能障碍在流感相关的发病和死亡中起到作用，例如：（i）在相当一部分住院的流感患者中观察到心肌炎，（ii）有报告称致命的季节性流感病例在尸检时有心脏损伤，（iii）几乎所有死于 1918 年流感病毒大流行的患者都有严重的心脏损伤；（iv）在流感季节，尤其是在未接种疫苗的人群中，心脏病案例逐年增加。然而，目前对流感病毒导致心脏病变的基本机制仍知之甚少。
尽管已在人类和非人类灵长类动物心脏样本中检测到活病毒，但对心脏的直接感染却很少被研究。相反，目前科学界认为严重感染的肺部会产生具有全身性心脏毒性炎症的细胞因子风暴，从而间接导致心脏功能障碍。由于缺乏用于流感介导的心脏病理学的易操作的动物模型系统，解决这一基本问题的尝试受到了阻碍。干扰素诱导的跨膜蛋白 3（IFITM3）是一种先天性免疫蛋白，能阻止病毒与细胞膜的融合，近期报道了缺乏 IFITM3 的小鼠在感染流感病毒后会出现严重的心电功能障碍和纤维化，从而为流感相关的心脏并发症提供了研究模型。
2022 年 5月 11 日，美国俄亥俄州立大学的研究人员在 Science Advances 杂志上发表了题为“流感病毒在心肌细胞中的复制导致心脏功能障碍和纤维化”的研究论文。该研究通过基因组掺入心肌细胞中表达的 miRNA 的靶序列，产生了一种新型重组心脏减弱的流感病毒，用以感染小鼠，作为研究流感相关的心脏病理模型。该研究表明，尽管心肌细胞中的病毒复制有助于 IFITM3 KO 小鼠的致死，但心肌细胞感染并不是唯一的死亡原因，与流感相关的心脏病需要在心脏中直接进行病毒复制。
为了从 IFITM3 knockout（KO）小鼠的心脏感染中解开全身性肺部炎症，我们试图选择性地减弱心肌细胞中的流感病毒。为了区分 IFITM3 KO 小鼠的系统性肺部炎症和心脏感染，研究人员试图选择性地减弱心肌细胞中的流感病毒。流感病毒株 A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）（PR8）是一种适用于小鼠的致病病毒，之前的研究发现它会从 WT 和 IFITM3 KO 小鼠的肺部传播到心脏。因此，选择这种病毒作为基于 miRNA 的心脏特异性减毒策略。使用先前建立的 miRNA 靶向策略与反向遗传学技术相结合，将 miR133b 和 miR206 的靶序列的两个拷贝插入流感病毒核蛋白（NP）基因片段，这两个 miRNA 在肌肉细胞（包括心肌细胞）中特异性表达，并且在先前的研究中用于实现柯萨奇病毒 B3 的心脏减毒。对照病毒（PR8-miRctrl）在同一个 NP 基因段插入点上含有一个长度匹配的非靶标序列（图 1A）。两种工程病毒在含胚鸡卵中都生长到相似的高滴度，表明在没有特异性 miRNA 靶向的情况下，工程病毒的相对复制能力不受影响。
图1. PR8-miR133b/206 在体外成肌细胞中减毒。
为了验证 PR8-miR133b/206 在表达相关 miRNA 的细胞中被减弱，研究人员感染了 C2C12 小鼠的成肌细胞系。与对照病毒相比，PR8-miR133b/206 在 C2C12 细胞中显著减毒，表明 miRNA 133b/206 的靶向有效限制了对成肌细胞的感染（图 1B）。作为对照，观察到两种病毒在不表达鼠 miR133b/206 的人胚胎肾（HEK）-293T 细胞中的感染没有显著差异（图 1C）。总之，研究人员将 PR8-miR133b/206 确立为一种在肌细胞样细胞中具有感染性的、有复制能力的减毒病毒。
为了测量 PR8-miR133b/206 与对照病毒相比的整体致病性，研究人员感染了 WT 和 IFITM3 KO 小鼠并跟踪它们的体重减轻和生存情况。与 IFITM3 KO 小鼠的疾病严重程度增强一致，在两种病毒感染时，KO 动物的体重损失明显高于 WT 小鼠（图 2A）。比较各个小鼠基因型中的病毒，发现靶向 miR133b/206 并没有显著改变流感病毒诱导体重减轻的能力（图 2A）。由于流感病毒感染期间的体重减轻通常是由细胞因子诱导的食欲不振引起，这些数据表明这两种病毒诱导了相似水平的肺源性炎症。为了测试这一点，研究人员用 PR8-miRctrl 或 PR8-miR133b/206 感染了另外一组 IFITM3 KO 小鼠，并通过 ELISA 测量血清细胞因子水平来检查系统性炎症。结果发现，在两种病毒感染时，典型促炎细胞因子 IL-6、IL-8、TNFα 和 IL-1β 的血清水平相似（图 2B-2E）。
图2. 流感病毒心脏感染的减弱不会显著改变发病率，但会降低 IFITM3 KO 小鼠的平均存活时间。
同样，所有 WT 小鼠都从任一病毒株的感染中恢复，而两种感染在 IFITM3 KO 小鼠中都是致命的（图 2F）。尽管 IFITM3 KO 小鼠的体重减轻相似，但与 PR8-miRctrl 感染相比，PR8-miRR133b / 206 感染在生存率方面产生了适度的，统计学上显著的优势（图 2F）。这些数据表明，心肌细胞中的病毒复制可能有助于 IFITM3 KO 小鼠的更快的死亡，总体而言，这些结果数据与重组病毒可以将肺部炎症的影响与流感相关心功能不全的发展去关联的前提是一致的。
为了验证这种工程病毒在剖析心功能障碍的决定因素中的效用，首先检查了 PR8-miR133b/206 和 PR8-miRctrl 感染后的病毒载量和肺部炎症。如图 3A 所示，在WT小鼠感染后第 5 天和第 10 天，PR8-miR133b/206 与 PR8-miRctrl 的肺部复制相当。与预期一致，IFITM3 KO 小鼠的病毒滴度高于 WT 小鼠（图 3A），但在比较 PR8-miRctrl 与 PR8-miR133b/206 时，肺中的病毒滴度相似（图 3A）。为进一步证实 PR8-miR133b/206 肺部感染没有减弱，测量了肺匀浆中的 IFNβ 和 IL-6 水平，发现这些促炎细胞因子在被两种病毒感染的小鼠的肺中没有显著差异（图 3B，3C）。此外，还观察到 IFITM3 KO 小鼠与预期一致显示出比 WT 小鼠更严重的肺组织病理（图 3D）。两种病毒诱导气道细胞实变的水平一致（图 3E）。结合结果数据（图 2A，2B），对比肺部病理和炎症表明，新型 PR8-miR133b/206 病毒在肺部没有减弱。
图3. PR8-miR133b/206 在体内肺中是完全致病的。
为了检验 PR8-miR133b/206 感染是否在心脏组织中减弱，研究人员在用于得出肺部数据的同一实验小鼠中量化了病毒滴度（感染后 5 天和 10 天）。PR8-miRctrl 组与预期一致，观察到在 WT 小鼠心脏中主要是低的或检测不到的病毒滴度，而在 IFITM3 KO 小鼠的心脏组织中，两个时间点的滴度都显著较高（图 4A）。在 PR8-miR133b/206 组中，WT 小鼠心脏中检测不到活病毒，而 IFITM3 KO 小鼠心脏中的平均滴度明显低于对照病毒，这证实了 miR 靶向病毒在心脏中复制的整体减弱（图 4A）。通过 miR 靶向对病毒的心肌细胞特异性减毒揭示了心肌细胞直接感染在流感相关心脏炎症中的重要作用，在 IFITM3 KO 小鼠中表现为：（i）心脏病毒平均滴度大约降低 1 - 1.5 log，（ii）炎症细胞因子 IFNβ 和 IL-6 的水平显著降低（图 4B，4C），以及（iii）CD45 阳性免疫细胞浸润减弱（图 4D，4E）。
图4. PR8-miR133b/206 在体内心脏中被减弱。
纤维化是一种广泛观察到的严重感染性损伤人类心脏组织的后果。IFITM3 KO 小鼠在感染流感病毒后表现出显著的心脏纤维化，而设计的心脏减毒病毒没有减轻肺部炎症，可以测试心脏病理是否需要强烈的心脏感染或由严重的肺部炎症间接诱发。因此，在感染后第 10 天收集了 WT 和 IFITM3 KO 小鼠的心脏，并使用 Masson 三色染色进行纤维化的组织学分析。心脏切片显示，，蓝染的纤维化病变在感染了 PR8-miRctrl 的 IFITM3 KO 小鼠的心脏中最为明显，WT 样本和感染 PR8-miR133b/206 的 IFITM3 KO 小鼠的纤维化损伤较小（图 5A）。来自多只小鼠的图像的定量分析证实，与感染 miRctrl 病毒相比，感染 miR 靶向病毒的 IFITM3 KO 小鼠的心脏样本的纤维化染色显著较低（图 5B）。此外，还通过测量心脏特异性肌酸激酶同工酶 （CK-MB）在血液中的分泌来研究 IFITM3 KO 小鼠中心脏损伤的循环迹象，发现与对照病毒相比，感染 PR8-miR133b/206 的小鼠心肌细胞损伤的这种生物标志物减少（图 5C）。因此，病毒在心脏中复制的减弱与感染后心肌损伤和纤维化的减少相关，表明病毒在心肌细胞中的直接复制是流感相关的心脏病变发展的必要条件。
图5. 病毒在心脏中的复制是感染期间诱发纤维化的必要条件。
鉴于心脏纤维化是心脏电传导不规则的公认危险因素，并且在感染 PR8-miR133b/206 时纤维化显著减少（图 5），研究人员测试了流感病毒诱发的心脏电功能障碍是否同样需要直接感染心肌细胞。结果显示，WT 小鼠的心脏功能在整个感染过程中基本没有变化，IFITM3 KO 小鼠在 PR8-miRctrl 感染过程中表现出降低的心率（图 6A）。同样，在感染 PR8-miRctrl 的 IFITM3 KO 小鼠中，RR 间期，即心电图迹线上主要峰（R 峰）之间的时间测量值，与心率成反比，相应升高（图 6A）。此外，还在感染 PR8-miRctrl 的 KO 动物中观察到不规则的心电图描记，而这种表型在大多数感染 PR8-miR133b/206 的 IFITM3 KO 小鼠中基本不存在（图 6B）。尽管这些值的变异性可能源于多种因素，但观察到的与未感染小鼠基线值的差异以及与心率下降相关的明显节律差异，表明感染 PR8-miRctrl 后 IFITM3 KO 小鼠的心脏功能发生了病理变化（图 6B，6C）。总的来说，尽管病毒复制和肺部炎症很强，但观察到 PR8-miR133b/206 感染的心脏病毒滴度减弱伴随着心脏电功能障碍的减少。得出结论，流感相关的心脏纤维化和电功能障碍需要病毒在心脏中直接复制。
图6. 病毒在心脏中的复制会在感染期间导致心脏功能障碍。
由流感病毒感染引发的心脏病症广泛归因于严重的肺部炎症，这会导致全身组织损伤并加剧先前存在的心脏疾病。然而，由于缺乏非侵入性临床试验来鉴别流感病毒直接感染心脏，因此很难确定肺部炎症与病毒直接引起的心脏损伤在严重感染期间心脏功能障碍的相对贡献。该研究以 IFITM3 KO 小鼠作为组织特异性严重感染模型来研究流感诱发的心脏功能障碍。为了操纵流感病毒在心肌细胞中复制的能力，构建了一种具有心肌细胞特异性 miRNA 靶点的新型重组病毒株。结果发现，将 miR133b 和 miR206 的 miRNA 靶点插入甲型流感病毒 PR8 株的 NP 基因组片段中，可有效减弱小鼠体外心肌细胞样细胞和体内心脏的感染（图 1，4）。此外，心脏中病毒载量的减少与较轻的心脏纤维化、炎症、循环肌酸激酶水平和电功能障碍相关，尽管肺部病毒复制和炎症以及全身性炎症仍然很强（图 3，5 和 6）。因此，该研究表明，与流感相关的心脏病需要在心脏中直接进行病毒复制。但是，仍有一些关键问题有待解决，例如控制病毒从主要感染部位传播到心脏或其他肺外部位的机制，了解呼吸道病毒在肺外组织中的直接和间接影响对于防治这些病理性疾病也至关重要。
原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abm5371
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